云南普洱茶是指，以云南大叶种制作的晒青绿茶为原料，经过适当的堆积发酵过程，制作而成的后发酵茶。根据发酵方法的不同，又可以将普洱茶分为“普洱生茶”和“普洱熟茶” 两种。将刚刚采摘的新鲜茶叶，通过杀青（即采用高温破坏和钝化鲜叶中的氧化酶活性的工程）、揉捻、自然日晒风干后制作而成的晒青绿茶即是“普洱生茶”；将“晒青绿茶”在加温加湿的环境下进行发酵后制成的茶叶是“普洱熟茶”。现在市面上广泛销售的绝大多数是“普洱熟茶”。
因与云南普洱茶历史相关的记录很少，我们很难清楚的知晓其历史全貌。但根据周1）的报告，唐代时期产于南诏银生城（现在的云南省普洱市）一代山地上的茶，闻名全国；到了明代，作为“普洱茶”被广泛认知；清代时期，普洱茶被指定为云南的进贡物品，朝中大臣们也非常爱喝。但清代之前的普洱茶都是“普洱生茶”，据说为了生产年份越久越香，拥有陈香的普洱茶，要花费数年至数十年的时间。因此，一个能在短时间内制成拥有年份口感的普洱茶，并进行批量生产的制作方法-“温水发酵速成法”在1975年的昆明茶厂产生了。与此同时，与发酵普洱茶相关的研究也开始受到关注，近年来围绕着对普洱茶品质最具影响的发酵期，对发酵期间微生物与品质之间的关系，发酵期间茶叶含水量及加水量与品质的关系，即发酵过程中茶叶的温度及茶叶中的含氧量与品质之间的关联进行了调查。
将普洱茶所含的多酚等成分与其他茶叶所含的进行比较研究，得出了在发酵过程中多酚总量的变化及茶叶成分变化对普洱茶品质具有什么影响的研究成果。在普洱茶功能的研究方面，有普洱茶的促进脂肪代谢效果的研究，普洱茶热汤的提取物及其分化物有抗变异和抗癌的功效等的报告。
一般认为，开水泡茶后，茶汤是鲜艳的栗红色，茶香浓郁，且饮后回味甘甜的普洱茶是上乘的普洱茶。但是要想生产出同时具备以上特征的优质普洱茶，就需要对发酵条件的各个方面进行探讨。现在云南省的产茶地，对于普洱茶的发酵条件，仅考虑到发酵茶叶的含水量和温度，也就是发酵过程中的堆积室的温度。并且，在成分研究方面，仅限于对制成品成分量的分析以及作为原料的晒青绿茶与制成品称分量的比较，也就是说成分量的变化与产品质量之间的关系。然而却找不到，与最为影响茶叶品质的发酵过程中所含多酚类，茶黄素及咖啡因增减情况相关的研究。因此，作者们考虑，若能从质的方面和量的方面把握多酚类，茶黄素与咖啡因的变动趋势，就可以根据成分的变化情况设定发酵期的长短。
本研究，以云南普洱茶在发酵过程中多酚类，茶黄素及咖啡因成分为着眼点，详细调查这些成分的变化，服务于优质普洱茶的生产。
第一章：材料及方法
第一节：材料
我们使用由镇康县、双江县以及景谷县三个区域采摘来的一芽两叶和一芽三叶的茶叶加工制作的晒青绿茶，在云南农业大学普洱茶研究院里进行了普洱茶的加工。加工过程从发酵开始，十天六次，每次选择3个样本进行对比试验。
第二节：“普洱熟茶”的制作方法
普洱熟茶的一般制法如图一所示。中文称为“潮水渥堆”的堆积工程的发酵条件如下所示。将10吨晒青绿茶以80cm的厚度平铺的在堆积室中进行堆积发酵，并保持发酵过程中茶叶的含水量在30-35%的程度。因为晒青绿茶在发酵开始时的含水量约在12%左右，首先要加水使茶叶的含水量达到35%。接下来用湿布和苫布覆盖，控制发酵过程中的温度的同时，促使黑曲霉菌，青灰色曲霉菌，谢瓦利埃曲霉菌属，桔青霉等细菌的生成。发酵期间的含水量，每十天调整一次。
首先，在堆积起来进行发酵的茶堆的中央部位，深约40cm之处采集样本，采用常压１０３±2℃加热干燥法（恒量法）进行水分测定。具体的操作是，将称量容器（直径55毫米，深约15毫米，带盖重量约为10克的铝制器皿）放入调好固定温度的恒温干燥器（101―A型，中国·上海崇明试验机器公司）中，加热一小时之后移至保干器中放置45分钟，之后进行称量精确到0.1毫克以求恒量。采集三克样本，放入称量器，带盖进行称量，同样精确到0.1毫克（Ｗ１）。然后将打开盖子的称量器放入干燥器中，当干燥器的设定温度达到（１０３±2℃）时，对其进行两个小时的干燥，之后立即在干燥器中盖上称量器的盖子，并将称量器移至保干器中，冷却至与室内温度相同时进行称量，随后再次打开盖子放入干燥器中，进行干燥、称量、反复操作直至达到恒量（Ｗ2）。接下来，运用（Ｗ1－Ｗ2）∕（Ｗ1-Ｗ0）×100的公式计算样品中的含水量率（%）。用喷雾器添加流失的水分，再次使茶叶中的含水量调整至35%的程度。加水的时候，为了使水均匀覆盖发酵中的所有茶叶，要将茶堆铲平边搅拌边加水。加水是结束后，再次做成茶堆状，再次采集样本，用之前所述恒量法确认茶叶中的含水量在35%的程度后，用湿布和塑料布覆盖促使其进一步发酵。这个方法十日内重复五次。
其次需要维持发酵过程中茶叶的温度在45-55℃之间。关于发酵茶叶温度的控制方法，一般通过对茶堆中间部位深约40cm处温度的测量来随时监测茶叶的温度，并通过发酵茶叶表面覆盖的湿布和塑料布的取盖以及天花板上风扇的送风对温度进行调节。
实施发酵处理的堆积室的湿度需要保持在70～75％之间，在堆积室内安装湿度计以便随时监测湿度变化，并通过堆积室门窗的开关和水的喷洒，控制堆积室湿度的变化幅度在70～75％之间。使用可同时监测温湿度的温湿度计（Ｔesto635-2，德国，德图制造）。并且，每隔十日在搅拌前采集原料样本，用恒量法测量含水量。第一个表显示的是每隔五天测量得到的发酵茶叶的温度与湿度相关的数据，以及每隔十天测量得到的含水量的数据。
关于普洱茶的发酵期，一般认为控制在40天-60天之间比较合适，但是也没有统一规定。发酵过程中，每隔十天对发酵中的茶叶进行一次搅拌，将发酵后的茶叶进行自然干燥至含水量11%的状态。这样做出来的茶得形状是散的，所以称为 “普洱散茶”。将散茶进行蒸压，做成圆盘形或者砖状的方形后，进行干燥处理制作成普洱茶。本次试验采用的是整形处理前的“普洱散茶”。
第三节：多酚及咖啡因的提取与分析
多分的分析采用的是桥本16.17）的方法，精确称量3克茶叶，加入80％性丙酮60毫升，常温下静置一天后提取多酚类成分。三天反复提取三次。将提取液用棉饼过滤过后，通过降压使溶剂蒸发，采用柱色谱分离法，依次用水和50%甲醇或者70%甲醇将残渣洗提出去、洗提夜全部回收。回收的洗提夜在低压状态下蒸发后，凝结。对干燥粉末进行称量后，从其中称量出3毫克，使其溶解在70%甲醇中，全部10毫升导入微孔过滤器（0.45微米）后、使用高效液相色谱进行三次分析，通过一点检量法以标本的最大面积为基准计算出浓度的平均值，并换算每一克干燥茶叶的含有量。
标本采用了，（-）表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯（EGCG）、（-）表没食子儿茶素(EGC) 、（-）表儿茶素-3-0-没食子酸酯（ECG）、(-)表儿茶素（EC）、（+）-儿茶素（CA）、（±）没食子儿茶素(GC)、TG、STR、 1，4，6-tri-0-G-β-D-G,没食子酸（GA）和咖啡因等11种。
高效液相色谱分析所需装置和条件如下所示。
电源：TOSOH PS-8010
泵：TOSOH CCPM
柱：TOSOH TSK gel ODS-80TM（4.6ｍｍ?ｘ250ｍｍ）
检测器：TOSOH 紫外线可视检测器UV－970
检测波长：280毫米
柱温：40℃
移动相：A液体（0.05 M、 H3PO４―H２O）－５％CH３CN;
B液体（0.05M H３PO４―H２O ）―80％CH３CN;线型磁场勾配法
浓度勾配：B液（0分）－53％（55分）
进样量：10 μ1
流速：每分钟0.7毫升
第二章：结果
ZEGCG：（-）表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯、EGC：（-）表没食子儿茶素、ECG：（-）表儿茶素-3-0-没食子酸酯、EC ：(-)表儿茶素、CA：（+）-儿茶素、GC：（±）没食子儿茶素、GA：没食子酸、TG：甘油三酯，STR、1，4，6-tri-G-G 、CFA：咖啡因
Y 平均值±标准偏差(n=3)
X根据Fisher,Ronald Aylmer（1890.2.17～1962.7.29）的最小非偶然性差法不同地区茶叶样品的成分含量，分别以1% (**) 5%(*)的存在非偶然性差别标志以及 n.s没有非偶然性差来表示。
第二图发酵过程中多酚含量(平均值)的变化 第三图发酵过程中加水分解型 单宁和咖啡因的含量的(平均值)变化
Z不同的字母序列之间表示根据fisher的 Z不同的字母序列之间表示根据fisher的
最小非偶然差法存在1%水平的非偶然差 最小非偶然差法存在1%水平的非偶然差
表二反映的是，晒青绿茶、发酵过程的样品、以及经过60天发酵过程后制成的普洱茶中所含的多酚类和咖啡因的含量。为了确认三地各采集的样本中以上元素的含量存在偏差，进行了双向设置对比分析。结果发现，采摘了一样成熟度的茶叶（嫩芽）在同样发酵条件下制作而成的三个地区的样本中EGCG 、ECG、EC、CA、TG 、1，4，6-tri-0-G-β-D-G 、STR的含量存在1%水平的非偶然之差，GC和GA的含量有5%水平的非偶然之差。但是，EGCG与咖啡因的含量上并没有发现区域之间的非偶然之差。
另一方面，发现与地域的差别无关，EGCG 、ECG、EC、CA、TG 、1，4，6-tri-0-G-β-D-G的含量随着发酵过程的推移逐渐减少，与之相反GA与咖啡因的含量却逐渐增加。并且，EC和EGC的含量，在发酵10天后的一段时间有增加的倾向。
第2图显示的是，发酵过程中EGCG 、EGC 、ECG、EC、GA含量的变化情况。含量表示的是各地区采集所有标本的平均值。从晒青绿茶到经过60天发酵后制成的普洱茶，EGCG 和ECG的含量非偶然性（1%的水平）不断减少，但是在发酵过程开始后的第50天至第60天期间一直维持着一个低值。EGC 的含量在发酵第10天之前，以1%的水准非偶然性的上升，但是之后却以1%的水准不断减少，在第40天至60天期间维持着一个低值。EC的含量在发酵开始后的第十天值最高，之后非偶然性的减少，但是从第40天开始几乎没有变化。如此得出，EGCG 、EGC 、ECG、EC、这四种多酚伴随着发酵非偶然性的不断减少，但是GA的含量在发酵第40天之前非偶然性的增加，之后不断减少。
第三个图显示了，具有水解作用的鞣酸TG、STR、1，4，6-tri-0-G-β-D-G以及咖啡因含量随着发酵过程的不断变化的情况。上述的水溶性单宁酚的含量，伴随着发酵过程非偶然性的（1%）水平不断减少，但是在发酵的第40天开始至第60天期间维持着一个低值。咖啡因的含量伴随着发酵过程不断增加，发酵第60天咖啡因的含量与发酵过程中咖啡因的含量相比，非偶然性的要高很多。
在不同的发酵时段，采取与分析多酚和咖啡因相同的方法，对红茶色素中的茶黄素进行分析，但是完全没有化验出来。
第三章：考察
吕先生的报告中指出，GA的含量一开始伴随这发酵的过程不断增加，这与我们本次试验得出的结果完全相同。（如图2）龚先生们的报告中指出，接种微生物的晒青绿茶经过发酵后多酚的含量减少，以及与EGCG 、EGC 、ECG、EC等儿茶素的含量也随发酵不断减少相反，GA（没食子酸）的含量不断增加。再者，作为爱茶人士的高桥先生1988年，指出普洱茶中所含的单宁酸的含量明显低于其他茶类，特别是黄烷-3-醇类的含量非常少；并且由于在制造过程中所含的曲霉菌等菌类具有非常强大的酯酶活性，促使GA（没食子酸）的生成。另一方面，明确指出GA（没食子酸）作为黄烷-3-醇类的营养源被消耗。以上研究与本实验的结果大致相同。也就是说，我们可以明确掌握以下两点：（一）与其他茶相比较，普洱茶中单宁酸的含量明显较低（特别是黄烷-3-醇类的含量特别低），而GA（没食子酸）的含量与绿茶和其他发酵茶相比明显较高；（二）发酵过程中黄烷-3-醇的含量急剧减少而GA（没食子酸）的含量却不断增加。
因此，我们推测伴随着发酵的开始，黑曲霉菌、曲霉菌、阿曲霉、青霉菌等微生物大量增殖，这些微生物所产生的酯酶作用使酯类加水分解并生成GA（没食子酸）。并推测，实际上加水分解型的单宁类同样作用于微生物加水分解生成A（没食子酸）的过程。
从本次的实验结果我们可以清楚的看到，截至发酵后的第10天，作为原料的晒青绿茶中，酯型儿茶素的EGCG 和EGC的含量减少了将近一半，而GA（没食子酸）的含量增加了将近10倍；同样我们可以很清楚的看到，非酯型儿茶素的EGC和EC的含量方面，在发酵的第十天，EGC的含量非偶然性的增加，虽然增幅很小但EC的含量也有所增加，非酯型儿茶素类的含量在发酵第十天之前都没有减少（如图2）。因此我们推测，与非酯型儿茶素作为微生物的营养源开始被消耗无关，由于酯型儿茶素通过加水分解不断供给非酯型儿茶素，才使得非酯型儿茶素从表面上看不出减少。事实证明我们的推测是正确的。发酵期的第20天及其以后，在这种供给完全消失不见后，非酯型儿茶素确实开始减少。
并且，发酵处理的第20天至第60天，EGCG 和EGC不断分解减少，但是它减少的比例与GA增加的比例相比非常少（如图2）。也就是说，GA（没食子酸）含量的增加需要其他酯型儿茶素作为供给源，考虑到TG、STR、 1,4,6-tri-0-G-β-D-G这三种加水分解型单宁含量从发酵开始截至发酵期的第40天非偶然性的减少（如图三所示），我们推测加水分解型单宁就是GA（没食子酸）的供给源头。
有报告指出，在普洱茶的制造过程中，多酚等的苯酚类释放出水素离子变换成醌，并聚合生成茶黄素（Theaflavin）等红茶的红色素4.13）。另一方面，也有报告说，普洱茶色素并不是通过多酚的变换生成的物质，考虑是微生物的由来；并认为红茶和乌龙茶中的红色素，全是化学制造的性质完全不同物质，普洱茶的色素在红茶里面并不存在。本次试验，一直在检测茶黄素的生成，但是从发酵开始到发酵的第60天为止，在所有的样本中都没有化验出来茶黄素。由此我们第一次明确，被认为是通过发酵生成的普洱茶色素和红茶的色素完全是不同的性质的东西。
关于黄嘌呤（xanthine ）生物碱，根据周关于咖啡因，可可碱，茶碱随着发酵过程不断变化的报告指出，咖啡因伴随着发酵逐渐减少，而可可碱和茶碱却随着发酵以微小的幅度不断增加。这次试验，关注咖啡因，其含量的随时变化进行定量的时候，经过发酵咖啡因的含量伴随着发酵不断增加，制成品的含量与这些咖啡因的含量相比较，尅找到一个最高值，这个结果与周的记载相反。我们在想是不是云南茶厂和茶研究机构的咖啡因分析技术以及分析精度上有问题呢。还有，黄嘌呤（xanthine ）生物碱的增减特别是可可碱和茶碱的增减，今后要好好进行一下探讨研究。
关于最为影响云南普洱茶品质的形成发酵过程，报告了很多研究案例。但是这些研究大多数局限于对制成品成分的分析，原料的晒青绿茶与制成品之间成分的比较，成分含量的变化与品质之间的关系的研究。因此，为了确定普洱茶制造工程的发酵期的长短，很难说有这些信息就足够。并且，虽然一般认为发酵期控制在60天的程度比较合适，但是大多数云南茶厂都根据长期以来积累的经验进行普洱茶的制造。结果导致，不同地域和不同工厂品质参差不齐，普洱茶市场混乱。为了统一云南普洱茶的制造方法，确定发酵期的长短成为一个重要的课题，因此我们认为与成分相关的数值型指标非常必要。在本次试验得出的结果是，从发酵开始到第30天多分的含量显著减少，但是在发酵期开始的滴30天和第40天多分的含量几乎没有变化。我们认为由于第40天以后多酚减少的幅度变得更小，为了制造出优良的普洱茶，发酵期间30天应该足够了。但是，韩认为若是以普洱熟茶的感官评价为基准，即汤色，香气，茶味，茶渣这些方面。发酵30天的普洱熟茶汤色接近鲜红，但是与发酵40天的普洱熟茶相比茶色的明亮度不足；经过30天发酵制成的普洱熟茶的茶香与发酵40天的普洱熟茶进行比较残留有霉味香气不足；茶味方面发酵30天的普洱熟茶要比发酵40天的普洱茶涩一点，不醇厚清爽，回甘不足。并且叶底方面发酵30天的普洱茶和发酵40天的普洱茶，茶叶的颜色都是良好的褐红色，但是发酵30天的普洱茶的茶叶有点硬柔软度不足。在本次研究中，发酵60天的普洱茶中苦味成分的咖啡因的含量比发酵期间的含量高出很多。龚先生们也指出，发酵时间越长茶汤月浓，茶叶带黑，对茶的品质有不好的影响。因此若是能制造适当保有拥有机能成分的多酚，感官上感觉也良好的普洱茶，并提出发酵四十天足够的提案。
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